Приоритетное направление: «Наука о жизни и здоровье»

Специализированное направление: Изучение, сохранение и рациональное использование генетических ресурсов Казахстана. Инновационные подходы к мониторингу и охране окружающей среды. Влияние факторов окружающей среды на здоровье человека

Вид исследования: Фундаментальное

Срок реализации – 2023 – 2025 гг.

Руководитель программы – к.б.н., Перфильева А.В.

Научная новизна и актуальность проекта. 

Порода Тобет является не только уникальным генетическим ресурсом, но и древним, национально-культурным и историческим достоянием нашей страны. На протяжении веков собаки Тобет охранялимноготысячный скот кочевников, защищали скот от волков, наряду с хозяевами охотились на лисиц и даже использовались в качестве рабочей силы.

В настоящее время чистокровных представителей казахских тобетов осталось очень мало. Возможно, что в ближайшее будущее порода будет полностью потеряна, вследствие сокращения пастбищных угодий и уменьшение масштабов овцеводства, использования иных пород в качестве приотарных собак и использования Тобет для собачьих боев, стихийного разведения, и, наконец, отсутствия научной основы племенной работы. Сложившаяся ситуация требует принятия срочных мер по сохранению породы Тобет.

Цель Программы: Изучение генетических ресурсов казахской национальной породы собак Тобет и научных основ их криосохранения для обеспечения устойчивого восстановления и сохранения породы.

 

Ожидаемые результаты:

  • Будет создан уникальный банк биоматериалов и электронная база данных по сохранившимся представителям собак Тобет, что будет являться платформой для проведения запланированных исследований.
  • Будут составлены генетические паспорта собак Тобет; оценены генетические параметры популяции Тобет;  получена цветовая генетическая структура популяции посредством размещения исследуемых особей Тобет в наиболее вероятное число кластеров согласно алгоритму G. Evanno с соавт (Evanno et al., 2005); оценено количество микроядерных структур и цитологических нарушений в эритроцитах и буккальных эпителиоцитах и получены показатели частот и спектра хромосомных аббераций в лимфоцитах периферической крови собак Тобет; исследована способность лимфоцитов собак Тобет формировать адаптивный ответ при воздействии физических и химических факторов in vitro; оценены морфологические и микрометрические параметры волос собак Тобет.
  • Будет определено место породы Тобет филогенетическом дереве, выявлены родственные породы; описаны генетически узкие события в популяции (“бутылочное горлышко”); выявлены и аннотированы участки хромосом, которые подвергались селекции.
  • Будет определен эффективный метод выделения и культивирования in vitroсоматических клеток собак, изучено влияния криоконсервации и витрификации на выживаемость соматических и репродуктивных клеток, овариальной ткани собак. Будет создан криобанк ДНК и гермоплазмы собак Тобет как перспективный способ защиты породы от полного исчезновения в будущем.
  • Будет разработан ряд научно-обоснованных рекомендаций для селекционеров.

В рамках реализациий задач Программы на 2024 год:

— проведен комплекс мероприятий по созданию уникального банка биоматериалов и электронной базы данных по сохранившимся представителям собак Тобет, что является платформой для проведения запланированных исследований. Всего в 2024 году в рамках экспедиционных выездов, а также на выставках и специальных мероприятиях был собран биоматериал у cобак Тобет (n=99) из четырех регионов РК: Южного (n=52), Восточного (n=16), Северного (n=16) и Западного (n=5), а также из района (аймак) Баян-Ульгей, Монголия, (n=10), где проживают этнические казахи. По результатам анкетирования владельцев собак сформирована электронная база данных собак Тобет, сбор от которых проведен в 2023-2024 гг (n=163). В рамках выездов налажено сотрудничество с питомниками, отдельными заводчиками и владельцами Тобет.

— проведена оценка состояния генофонда собак породы Тобет (n=107) на основании ДНК-фингерпринтинга (18 микросателлитных маркеров). Впервые получены параметры их генетического разнообразия, выявлены популяционно-генетические особенности, получена цветовая генетическая структура популяции посредством размещения исследуемых особей Тобет в наиболее вероятное число кластеров. Показано, что Тобеты демонстрируют значительное генетическое разнообразие и сложную генетическую структуру, характеризующуюся семью отдельными кластерами, обнаруженными во всех изученных популяциях из трех регионов Казахстана и Монголии. Высокие уровни основных параметров генетического разнообразия и общий низкий уровень инбридинга, количественно оцененные с использованием микросателлитных локусов, свидетельствуют о метизации породы Тобет, а также о том, что система случайного скрещивания в исследованной популяции собак породы Тобет преобладает над инбридингом.

— генетические профили собак породы Тобет, полученные на основании ДНК-фингерпринтинга (микросателлитный анализ), оформлены в генетические паспорта (n=107) и выданы владельцам собак Тобет. Подготовлена памятка для владельцев собак, получивших генетический паспорт, с разъяснениями о том, как можно эффективно использовать этот документ.

— проведена сравнительная оценка параметров генетической изменчивости популяций собак породы Тобет из четырех регионов: Южный, Восточный, Северный Казахстан и Монголия. Показано, что Южно-казахстанская популяция имеет наибольшее генетическое разнообразие, но небольшой дефицит гетерозигот, что может свидетельствовать о незначительном инбридинге. Восточно-казахстанская и северо-казахстанская популяции демонстрируют умеренное разнообразие, при этом в первой наблюдается избыток гетерозигот, что указывает на межпородное скрещивание, во второй — небольшой дефицит гетерозигот. Монгольская популяция характеризуется наименьшим генетическим разнообразием и наиболее сильными признаками межпородного скрещивания.

— проведена оценка параметров генетической изменчивости собак породы Тобет в сравнительном аспекте с беспородными собаками, признанными эталоном высокой генетической изменчивости и генетической адаптации. Показано, что Тобеты демонстрируют даже несколько более высокое генетическое разнообразие по сравнению с беспородными собаками, несмотря на относительно небольшой дефицит гетерозигот.

— впервые проведено секвенирование полного генома собак породы Тобет (n=2), результаты отцифрованы и внесены в общепризнанный международный репозиторий генетических данных Sequence Read Archive (SRA, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra).

— на основе результатов полногеномного секвенирования построено филогенетическое древо (14 668 406 маркеров), характеризующее филогенетическое отношение породы Тобет с другими близкородственнными породами собак (25 пород). Показано, что Тобеты имеют тесную генетическую связь со Среднеазиатскими Овчарками и турецкой породой Акбаш. Не подтверждена распространенная гипотеза о близком родстве Тобетов и Тибетских Мастифов.

— определена гаплогруппа собак породы Тобет (n=2) с использованием специально разработанного биоинформатического конвейера для выделения митохондриальной ДНК из полногеномной последовательности, что позволило сделать выводы о древности этой породы. В обоих исследованных образцах был выявлен древний гаплотип A18.

— впервые проведена оценка генетического статуса собак Тобет с использованием микроядерного теста, цитомного анализа эпителиоцитов ротовой полости и анализа частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови. Показано, что частота микроядер и кариологических аномалий в буккальном эпителии ротовой полости у собак породы Тобет выше, чем у беспородных. Напротив, проведенный цитогенетический анализ частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови не выявил принципиальных различий в стабильности генетического аппарата у собак породы Тобет и аутбредных собак, однако непосредственно в группе Тобет наблюдались различия нестабильности генома по полу и возрасту. Проведено информирование владельцев Тобет, у которых отмечен высокий уровень цитологических и цитогенетических нарушений.

— для оценки морфологических и микрометрических характеристик волос собак породы Тобет и исследования возможности их использования в качестве малоивазивного доступного породоспецифического маркера проведено формирование выборок, сбор биоматериала и подготовка препаратов для трихологического анализа, проведена оценка морфологических и микрометрических характеристик волос собак породы Тобет и других пород.

— оптимизированы методы и изучены особенности криосохранения соматических клеток (фибробластов) собак породы Тобет, выделенных из кожных эксплантов. Изучено влияния витрификации (быстрое замораживание) на их жизнеспособность при использовании различных криопротекторов. Показано, что наиболее эффективным витрификационным раствором для фибробластов собак породы Тобет при температурах -196°C и -205°C является состав, включающий 4,5M DMSO, 5,5M EG и 1M сахарозы.

— проведен сбор и CASA анализ сперматозоидов cобак. Изучено влияния неуравновешенной (в парах LN) и уравновешенной (программное замораживание) криоконсервации, а также витрификации на их выживаемость. Показано, что добавление 1% витамина E в состав криопротекторов является оптимальным выбором как для неуравновешенной, так и для уравновешенной криоконсервации сперматозоидов собак. Кроме того, раствор BSA с сахарозой 0,2М является наиболее эффективным для витрификации сперматозоидов.

— Пополнен криобанк гермоплазмы собак породы Тобет (фибробласты и сперма).

Вся работа проведена согласно календарному плану. Задачи, поставленные на 2024 г., выполнены в полном объеме.

Всего по теме Программе в 2024 г. опубликовано 1 статья в журнале из базы Scopus; 3 статьи в изданиях, рекомендованных КОКСНВО; подана 1 статья в издание, рекомендованное КОКСНВО; получено 3 патента РК на полезную модель; подана 1 статья в журнал из базы Scopus; опубликован 1 тезис н международной конференции.

 

№ Выходные данные работ Ссылка
2024
Зарубежные публикации
Perfilyeva, A., Bespalova, K., Kuzovleva, Y., Mussabayev, R., Begmanova, M., Amirgalyeva, A., Vishnyakova, O., Nazarenko, I., Zhaxsylykova, A., Yerzhan, A., Perfilyeva, Y., Dzhaembaeva, T., Khamchukova, A., Plakhov, K., Torekhanov, A., Djansugurova, L., Zhunussova, G., Bekmanov, B. Genetic Diversity and Origin of Kazakh Tobet Dogs // Scientific Reports — Nature.

 

 https://doi.org/10.1038/s41598-024-74061-9

 
Отечественные публикации
2.                  6 Перфильева А.В., Беспалова К.Б., Бегманова М. О., Кузовлева Е.Б. Оценка генетического газнообразия гобак казахской национальной породы Тобет южного региона Казахстана //3i: intellect, idea, innovation — интеллект, идея, инновация, 2024, №1, С.58-67

 

 https://ojs.ksu.edu.kz/index.php/3i/article/view/852

 
3. Toishibekov T.Y., Toishybek D.Y., Nurkenov T.T., Katubayeva B.S., Salmenova M.Y., Perfilyeva A.V. Optimization of cryopreservation methods for somatic cells of the Tobet dog breed // The International Journal of Biology and Chemistry. Chapter «Biology»

 

 DOI: https://doi.org/10.26577/IJBCh2024v17i1-a3

 
4. Перфильева А.В., Беспалова К.Б., Кузовлева Е.Б., Беспалов С.В., Бегманова М.О., Абылкасымова Г.М., Сейсенбаева А.С., Вишнякова О.В. Оценка генофонда собак породы тазы с использованием микросателлитного анализа // Вестник Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева. Серия Биологические наук

 

 DOI:https://doi.org//10.32523/2616-7034-2024-147-2-58-68
5. Жунусова Г., Перфильева А., Беспалова К., Бегманова М., Кузовлева Е., Вишнякова О., Бекманов Б., Назаренко И. Генетическая структура казахской национальной породы собак тазы // Международная научно-практическая конференция «КОЧЕВНИКИ: ИСТОРИЯ, ЗНАНИЯ, УРОКИ» (Астана, Казахстан, 9–11 сентября, 2024 г.): Тезисы докладов / Дирекция 5-х Всемирных игр кочевников. – Астана: Smart University Press, 2024. – 316 с.

 

 https://worldnomadgames.kz/source/uploads/science/book_of_abstracts.pdf
Патенты
6. Патент РК на полезную модель № 8844 Способ криоконсервации фибробластов собак породы Тобет.

 
7. Патент РК на полезную модель № 8842 Способ криоконсервации овариальной ткани собак породы Тобет.

 
8. Патент РК на полезную модель № 8843 Способ ультрабыстрой витрификации зрелых яйцеклеток собак породы Тобет с использованием криопетли.

 

 

В рамках реализациий задач Программы на 2025 год (1 кв):

— продолжена реализация ключевого этапа полевых исследований — выездных экспедиций по регионам Казахстана с целью выявления представителей породы тобет, соответствующих или максимально приближенных к эталонному стандарту породы. Основной акцент был сделан на южные регионы страны, традиционно отличающиеся высокой плотностью исторически значимых популяций данной породы.

В рамках плановых экспедиций, а также в ходе участия в специализированных выставках и мероприятиях, был собран биологический материал (волосы с фолликулами, буккальный эпителий и/или периферическая кровь) от 84 собак. Отбор проводился на основании предварительного фенотипического анализа с участием экспертов-кинологов Республиканской ассоциации общественных объединений охотников и охотничьих хозяйств «КАНСОНАР». Все отобранные особи были дополнительно промерены с использованием унифицированного протокола кинологической оценки и зафиксированы фотодокументацией. Одновременно осуществлялось анкетирование владельцев, включающее сведения о происхождении животного, условиях содержания, репродуктивной истории и общем состоянии здоровья.

С учетом ранее проведённых этапов проекта (2023–2024 гг.), общее количество образцов в биобанке на текущий момент составляет 246 индивидуальных проб от собак породы тобет. Все данные — биологические, фенотипические и анкетные — внесены в централизованную базу данных, что обеспечивает полную прослеживаемость и позволяет проводить интегративный анализ на последующих этапах программы.

— проведено выделение ДНК из собранного биоматериала от собак породы тобет. Оценены качественные и количественные характеристики выделенной ДНК. Проведено широкогеномное SNP-сканирование для выделенной ДНК.

— проведено полногеномное SNP-типирование 204 особей казахской породы собак тобет. Генотипирование осуществлялось с использованием высокоплотной платформы Illumina iScan System с применением коммерческого массива Illumina Infinium CanineHD Genotyping BeadChip (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), охватывающего более 172 000 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), равномерно распределённых по 38 аутосомным и двум половым хромосомам собаки (Canis familiaris). Данный чип обеспечивает высокую разрешающую способность для оценки как внутри- так и межпородного генетического разнообразия, и используется в международных проектах по изучению селекции, популяционной структуры и генетики признаков у собак.

Качество генотипирования было проверено по ключевым метрикам (call rate, уровень дупликации, распределение генотипов). Все данные были интегрированы в единый файл. Полученный массив SNP-данных служит основой для последующего анализа генетической структуры, выявления сигнатур отбора, оценки инбридинга, анализа гомозиготных участков (ROH), а также для проведения филогенетических исследований.

— проведена комплексная оценка адаптационного потенциала казахской породы собак тобет по сравнению с беспородными собаками и близкородственными кавказскими овчарками. Целью исследования являлось выявление специфики реакций организма собак на воздействие факторов стрессогенной природы in vitro. Данный анализ адаптивного ответа является важным направлением в оценке резистентности породы к неблагоприятным условиям внешней среды и имеет прикладное значение для селекционно-сохранительных программ.

В качестве основного метода использовался тест G₀-хромосомной радиочувствительности, проводимый на лимфоцитах периферической крови. В исследование были включены образцы от 15 собак породы тобет, 15 беспородных собак и 7 кавказских овчарок. Образцы цельной крови собак в пластиковых флаконах облучали γ-квантами на аппарате дистанционной лучевой терапии с кобальтовым зарядом «Терагам» (НИИ онкологии и радиологии, Алматы, Казахстан) с номинальной энергией ускоренных электронов 1,5 МЭВ. Доза воздействия — 0,5 Гр мощность 0,1Гр/мин.

При воздействии γ-излучения общее количество ХА (8,01%) было статистически значимо выше контрольного уровня (3,04) (р≤0,05). Полученные данные демонстрируют несколько различный уровень частоты хромосомных нарушений, индуцируемых γ-излучением у тобетов (8,01) и аутбредных собак (7,51). Спектр выявленных аберраций соответствовал типу воздействия. Преобладание аберраций хромосомного типа (парные разрывы, фрагменты, дицентрики, транслокации) в общем спектре структурных нарушений хромосом свидетельствует о ведущем влиянии радиационного фактора.

Текущие результаты исследования свидетельствуют о том, что порода казахский тобет характеризуется повышенной чувствительностью генома к стрессовым воздействиям, проявляющейся в более высокой частоте хромосомных аберраций по сравнению с беспородными собаками. Дальнейшие этапы исследования предполагают расширение числа факторов воздействия.

— проведена оценка морфологических и микрометрических характеристик волос собак других пород с похожим типом шерстного покрова. Выявлены основные различия и сходства. Более подробная информация по данному направлению представлена в последующем подразделе.

— проведена комплексная морфологическая и микроскопическая оценка шерсти собак породы тобет и других пород с потенциальным сходством в структуре шерстного покрова. Исследование включало 133 образца шерсти от собак породы тобет и 39 образцов от представителей других пород (тазы, немецкая овчарка, тибетский мастиф, хаски, бурбуль, голден ретривер, аляскинский маламут, лабрадор, кавказская овчарка и кавказский волкодав).

Анализ осуществлялся по установленным протоколам, включающим визуальную оценку волос, получение микропрепаратов кутикулы и медуллы, а также морфометрические измерения. Особое внимание уделялось волосам с дорсальной части тела, преимущественно остевым, обладающим высокой идентификационной ценностью. Применялись классификационные схемы Куадроса и Монтейру-Фильо, De Marinis и других авторов.

Были выделены характерные типы кутикулярного узора для породы тобет, на основе которых все образцы разделены на две основные морфологические группы. Для сравнения были изучены особенности кутикулы и медуллы у других пород. Ряд пород (например, кавказский волкодав, лабрадор, голден ретривер) демонстрировал частичное сходство с представителями тобет, в то время как хаски, тибетский мастиф и немецкая овчарка показали ярко выраженные морфологические отличия.

Отдельный акцент был сделан на анализе медуллярной структуры: у большинства пород было выявлено преобладание одноклеточного неравномерного строения и вариативность в расположении светлых участков между клетками, отражающих таксономическую дифференцировку.

Полученные данные будут использованы для исследования возможности их использования в качестве малоивазивного доступного породоспецифического маркера.

— проведены экспериментальные исследования, направленные на оценку выживаемости овариальной ткани собак после медленного замораживания в парах жидкого азота на различных высотах (4 см, 5 см, 6 см) с применением различных криопротекторов.

Овариальные ткани были получены от собак различных пород после овариоэктомии, выполненной в ветеринарной клинике, с соблюдением всех этических и санитарных норм. После транспортировки в лабораторию в среде DPBS или L-15 с 5% FCS при температуре +37 °C, ткани были освобождены от связок, обработаны антибиотиками, и разделены на мелкие фрагменты стандартного размера (1.5–2.0 × 1.0–1.5 × 1.0–1.2 мм). Было подготовлено 144 фрагмента ткани, которые распределили на 12 опытных групп в зависимости от используемого криопротектора (диметилсульфоксид – DMSO, этиленгликоль – EG, пропандиол – PROH, глицерин – GL) и высоты над поверхностью жидкого азота (4 см, 5 см, 6 см). Эквилибрация тканей проводилась в три этапа с последовательным увеличением концентрации криопротектора и сахарозы. Замораживание осуществлялось в соломинках CBS CryoBioSystem объёмом 0,5 мл в течение 20 минут в парах жидкого азота с последующим погружением в жидкий азот и хранением в сосудах Дьюара. Размораживание проводилось методом резкого нагрева: соломинки извлекались из жидкого азота, выдерживались при комнатной температуре 30 секунд, а затем погружались в кипящую водяную баню на 60 секунд до полного оттаивания. Далее образцы фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина, парафинировались, изготавливались микропрепараты толщиной 5 мкм, окрашивались гематоксилином и эозином, и подвергались микроскопическому анализу. Всего было подготовлено 530 парафиновых блоков, 1320 гистопрепаратов и получено 7920 микросрезов. Оценка морфологии фолликулов проводилась по модифицированной классификации K. Oktay и Gougeon. Учитывались только фолликулы с видимым ядром. Статистическая обработка данных проводилась в Microsoft Excel с использованием t-критерия Стьюдента, статистически значимыми считались различия при p<0.05.

Во всех контрольных образцах ткань яичника сохраняла морфологическую целостность, уровень нормальных фолликулов составлял 97,3 ± 1,2%. Наиболее высокую выживаемость фолликулов среди замороженных образцов продемонстрировали группы:GL/4 см — 67,2 ± 2,5%; DMSO/4 см — 61,2 ± 4,1%; PROH/5 см — 70,2 ± 5,6%; DMSO/6 см — 55,2 ± 3,9%.

Микроскопическое исследование подтвердило наличие жизнеспособных фолликулов во всех указанных группах. В частности, при использовании глицерина на высоте 4 см наблюдалась хорошая сохранность как примордиальных, так и ранних антральных фолликулов, с сохранением структуры ооцитов и окружающих кумулезных клеток. При использовании DMSO и PROH также отмечались участки с хорошо сохранившимися фолликулами. Менее эффективными оказались криопротекторы этиленгликоль и пропандиол в условиях замораживания на высоте 6 см — морфологическая целостность фолликулов в этих группах была значительно нарушена.

Статистический анализ показал, что, несмотря на наблюдаемые различия между группами, статистически значимых различий между ними не выявлено (p>0.05), за исключением сравнения с контрольной группой, где отличия были достоверными (Pad, bd, cd > 0.05).

Таким образом показано, что использование 1,5 М глицерина при замораживании на высоте 4 см, 1,5 М диметилсульфоксида на высотах 4 и 6 см, а также 1,5 М пропандиола на высоте 5 см способствует наибольшей сохранности морфологически нормальных овариальных фолликулов у собак; этиленгликоль показал наименьшую эффективность, а оптимальные режимы замораживания зависят от комбинации высоты и типа криопротектора.

 

На основании полученных данных:

Опубликовано 2 статьи в журнале, рекомендованном ККСОН:

 

№ Выходные данные работ Ссылка
2025
Отечественные публикации
9.                  6 Чередниченко О. Г., Азизбекова Д. Э., Пилюгина А. П., Амиргалиева А. А. Сравнительная оценка нестабильности генома у казахских собак породы тобет и аутбредных собак с использованием неинвазивного метода // 3i: intellect, idea, innovation — интеллект, идея, инновация. – 2025 — №1 -С.93-102 DOI: https://doi.org/10.52269//22266070_2025_1_93

 
10. Мусаева А.С., Бекитаева А.К., Бахтыбеккызы Ш., Оразымбетова З.С., Арынгазиев Б.С., Хамдиева О.Х., Кузовлева Е.Б., Беспалов С.В., Бегманова М.О., Вишнякова О.В. Оценка морфологических характеристик шерсти собак породы тобет // ҚазҰУ хабаршысы. Экология сериясы – 2025 — Т. 82. — № 1 https://doi.org/10.26577/EJE2025821010

 

 

 

Приглашение к участию